پاورپوینت های علوم پایه

کلونینگ و بیان بخش های آنتی ژنیک سیتوتوکسین مرتبط با ژن A  (CagA) هلیکو باکتر پیلوری در باکتری اشرشیا کلی و امکان سنجی تولید IgY در زرده تخم مرغ   هلیکوباکتر پیلوری شایع ترین پاتوژن گوارشی است که نیمی از مردم دنیا را آلوده ساخته و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است.    ژن CagA (سیتوتوکسین مرتبط با ژن A) یکی مهمترین شاخص‌های بیماری زای این باکتری است.  در این مطالعه به منظور همانه سازی بخش‌های…

کلونینگ و بیان بخش های آنتی ژنیک سیتوتوکسین مرتبط با ژن CagA

کلونینگ و بیان بخش های آنتی ژنیک سیتوتوکسین مرتبط با ژن A  (CagA) هلیکو باکتر پیلوری در باکتری اشرشیا کلی و امکان سنجی تولید IgY در زرده تخم مرغ

 

هلیکوباکتر پیلوری شایع ترین پاتوژن گوارشی است که نیمی از مردم دنیا را آلوده ساخته و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است.

 

  ژن CagA (سیتوتوکسین مرتبط با ژن A) یکی مهمترین شاخص‌های بیماری زای این باکتری است.  در این مطالعه به منظور همانه سازی بخش‌های آنتی ژنیک ژن CagA و بررسی تولید IgY در زرده تخم مرغ در ابتدا بر اساس برنامه‌های بیوانفورماتیکی قطعه حاوی اپی‌توپ‌های اصلی ژن CagA به طول 996 جفت باز شناسائی شد سپس این قطعه به کمک PCR از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری موجود در بیوپسی معده 30 بیمار مبتلا به این باکتری جدا شده و با استفاده از هضم آنزیمی به ناقل  pET32a و سپس به داخل میزبان‌های کلون سازی و بیانی وارد شد.  نتایج توالی یابی کلونیگ موفق ژن CagA را نشان داد و در نهایت ترکیب پروتئینی بدست آمده توسط روش SDS-PAGE و دات بلات تائید شد. در مرحله بعد ترکیب پروتئینی بدست آمده به 3 مرغ از نژاد HY-LINE تزریق شد. تخم مرغ‌ها به مدت 10 هفته جمع آوری شدند و IgY تولید شده در زرده تخم مرغ آنها با استفاده از روش SDS-PAGE بررسی و تائید شد.

کلمات کلیدی: مهندسی آنتی بادی،کیت تشخیصی، ایمنوژنتیک

 

فهرست مطالب

1 مقدمه.. 1

1-1 اهمیت موضوع.. 1

1-2 اهداف تحقیق.. 4

2 بررسی منابع.. 5

2-1 مکمل‌ها و غذاهای عمل گرا.. 5

2-1-1 تفاوت غذای عمل گرا و مکمل غذائی.. 6

2-2 ایمنوگلوبین Y6

2-2-1 ایمنوگلوبین زرده ی تخم مرغ (IgY).. 7

2-2-2 ویژگی‌ها.. 9

2-2-3 کاربرد‌های بیوآنالایتیک.. 9

2-2-4 استفاده در مواد غذائی.. 10

2-3 هلیکو باکتر پیلوری.. 11

2-3-1 علائم و نشانه‌ها.. 11

2-3-2 میکروبیولوژی.. 12

2-3-3 ژنوم.. 13

2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری.. 14

2-3-5 نقش CagA در سرطان.. 15

2-3-6 پاتوفیزیولوژی.. 15

2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم.. 16

2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag.. 17

2-3-9 سرطان.. 18

2-3-10 آسیب شناسی.. 19

2-3-11 پیشگیری.. 19

2-3-12 درمان.. 20

2-3-13 پیش بینی بیماری.. 21

2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری.. 22

2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology).. 24

2-4 آنتی ژن‌ها.. 25

2-4-1 ساختمان آنتی ژن.. 25

2-5 اپی توپ‌ها.. 26

2-5-1 انواع اپی توپ‌ها.. 26

2-5-2 عملکرد.. 27

2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T.. 27

2-5-3 واکنش متقاطع.. 28

2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی.. 28

2-5-5 نشانه‌های اپی توپ.. 28

2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه.. 29

2-7 ابزار‌های مورد استفاده.. 38

2-7-1 دات بلاتینگ.. 38

2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench538

2-7-3 نرم افزار Mega539

2-7-4 ابزار BLAST.. 39

3 مواد و روش‌ها.. 40

3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 40

3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری.. 41

3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 41

3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز.. 41

3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده.. 42

3-5 طراحی آغازگرها.. 42

3-6 انجام واکنش PCR.. 43

3-7 خالص سازی محصول PCR.. 44

3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز.. 45

3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ.. 45

3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین.. 46

3-8-3 محلول غلیظ IPTG  (0. 1M).. 46

3-8-4 محلول غلیظ X-Gal  (20mg/ml).. 46

3-8-5 محیط کشت LB مایع.. 46

3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد.. 47

3-9-2 هضم pET-32a  (+)49

3-9-3 خالص سازی pET-32a  (+) و قطعه هدف.. 49

3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده.. 50

3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a  (+)50

3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α.. 51

3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α.. 52

3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری.. 52

3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب 53

3-9-10 کلونی PCR.. 53

3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب.. 54

3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی.. 55

3-10 توالی یابی.. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3)56

3-12 تحریک بیان ژن هدف.. 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری.. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE58

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد:.. 59

3-15 دات بلات.. 61

3-16 محلولها و بافرها.. 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS62

3-16-2 محلول بلوکه کننده.. 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T.. 62

3-16-4 آنتیبادی اولیه.. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه.. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB.. 62

3-17 خالص سازی پروتئین.. 64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ 64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی 65

3-19-1 تزریق اولیه:.. 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection).. 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ.. 66

3-21 جداسازی IgY با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول 6000 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات 67

4 نتایج و بحث.. 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 67

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی.. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA.. 69

4-4 بررسی محصولات PCR.. 70

4-5 خالص سازی محصول PCR.. 71

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA.. 71

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α.. 72

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+)73

4-9 نتایج کلونی PCR.. 73

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با استفاده از T774

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی.. 75

4-12 توالی یابی.. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA.. 76

4-14 بیان ژن.. 78

4-15 SDS-PAGE78

4-16 دات بلات.. 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ 81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات.. 85

 

فهرست شکل‌ها

شکل 4-1.  نتایج نرم افزار bcepred. 68

شکل 4-2. تست اوره آز انجام شده بر روی نمونه‌های بیوپسی. 69

شکل 4-3. تعیین کیفیت و کمیت DNA. 70

شکل4-5. خالص سازی محصول PCR . 71

شکل4-6. هضم ناقل بیان و قطعه هدف... 72

شکل4-7. کشت خطی از تک کلون‌های رشد کرده بر روی محیط کشت LB-آگار حاوی آمپی سیلین.. 73

شکل 4-8. کلونی PCR. 74

شکل4-9. کلونی PCR با استفاده از پرایمر T7 و T-terminatoor. 75

شکل 4-10. استخراج پلاسمید نوترکیب و هضم آنزیمی.. 76

شکل 4-12. بررسی بیان پروتئین نوترکیب با الکتروفورزSDS-PAGE 78

شکل 4-13. دات بلات پروتئینهای استخراج شده. 79

شکل 4-14.تعیین غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد. 81

شکل 4-15.خالص سازی پروتئین و حذف باند‌های غیر اختصاصی. 81

شکل 4-16. الکتروفورز SDS-PAGE به منظور بررسی پروتئین زنجیره سبک و سنگین IgY استخراج شده از زرده تخم مرغ   82

 فهرست جدول‌ها

جدول 3-1 مواد و مقادیر لازم برای انجام PCR یک واکنش.... 43

جدول3-2. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 44

جدول3-3 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت LB مایع.. 46

جدول3-4 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت جامد LB-Agar. 47

جدول 3-5 مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم قطعه هدف ژنCagA.. 48

جدول 3-6. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم pET-32a (+) 49

جدول3-7. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش الحاق.. 50

جدول 3-8. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم پلاسمید pET32a (+)-CagA.. 55

جدول3-9. مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Laemmli buffer samples 5X. 58

جدول3-10 مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل پایینی SDS-PAGE. 58

جدول 3-11 مواد لازم جهت بستن ژل بالایی SDS-PAGE. 59

جدول3-12. مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر 5X تانک SDS-PAGE. 59

قیمت فایل فقط 16,900 تومان

خرید


مراحل خرید:


1- پیش از خرید محصول توضیحات آن را به دقت مطالعه کنید زیرا محتوای فایل شامل تمام آن چیزی است که در توضیحات نوشته شده (نه کمتر و نه بیشتر)

2- پس از انتخاب فایل مورد نظر خود روی دکمه "دانلود" کلیک کنید
3- در مرحله بعد و در قسمت "تکمیل فرم خرید" مشخصات خواسته شده را به دقت وارد کنید و سپس روی دکمه "پرداخت و دانلود فایل" کلیک کنید.

(ایمیل را بدون www وارد کنید. نمونه صحیح ایمیل:  gsmyha@gmail.com)
3- در این مرحله به صفحه پرداخت وارد شده و با تمام کارت های عضو شتاب می توانید هزینه را واریز نمایید
4- پس از پرداخت موفق مجددا به سایت برگردانده می شوید و لینک دانلود برای شما نمایش داده می شود و علاوه بر آن یک نسخه از فایل به ایمیل شما هم ارسال می گردد تا با خیال راحت فایل خود را دانلود کنید.

(در صورتی که ایمیل فایل ناب به صندوق ورودی شما نرسیده ، باید پوشه اسپم را در ایمیل خود باز کنید و آنرا به صندوق ورودی انتقال دهید تا لینک دانلود فعال شود)


چند نکته مهم:

* پس از خرید فایل تا سه روز فرصت دارید تا فایل را بررسی کنید و در صورتی که فایل مطابق با توضیحات ارائه شده نبود از طریق بخش "تماس با ما" جزییات خرید را برای ما ارسال کنید تا پس از بررسی ، هزینه پرداختی شما را به حسابتان واریز کنیم.


* برای خرید محصولاتی که کمتر از 5000 تومان قیمت دارند نمی توانید از کارت بانک ملی استفاده کنید چون بانک ملی این اجازه را به دارندگان کارت بانک ملی نداده و به همین دلیل پیشنهاد می شود که برای خریدهای کمتر از 5000 تومان از کارت سایر بانکها استفاده نمایید.


* اگر صفحه لینک دانلود ظاهر نشود علت آن گزارش تخلف فایل و غیر فعال شدن فایل از طرف سایت می باشد. در این شرایط از طریق بخش "تماس با ما" جزییات خرید را برای ما ارسال کنید تا پس از بررسی ، هزینه پرداختی شما را به حسابتان واریز کنیم.

1  در هنگام خرید فایل به هیچ وجه از وی پی ان استفاده نکنید زیرا به احتمال زیاد خرید شما موفق نخواهد بود.


* در هنگام خرید از مرورگرهای فایرفاکس و کروم استفاده کنید و به هیچ وجه از مرورگر اینترنت اکسپلورر استفاده نکنید چون با توجه به آپدیت نشدن این مرورگر در چند سال اخیر ، در فرایند خرید و دانلود فایل اختلال بوجود خواهد آمد.

2 دانلود مرورگر گوگل کروم (نسخه 32 بیتی)

2 دانلود مرورگر گوگل کروم (نسخه 64 بیتی)

3 دانلود مرورگر فایرفاکس (نسخه 32 بیتی)

3 دانلود مرورگر فایرفاکس (نسخه 64 بیتی)


* برای حفظ کیفیت و همچنین دانلود آسانتر ، تمامی فایل ها فشرده شده و با فرمت rar یا zip آپلود شده اند. برای باز کردن فایل باید حتما نرم افزار win rar بر روی سیستم شما نصب شده باشد.

4 دانلود نرم افزار win rar (نسخه 32 بیتی)

4 دانلود نرم افزار win rar (نسخه 64 بیتی)


* در صورتی که از گوگل بصورت مستقیم به بخش دانلود وارد شده اید ، می توانید روی نام فایل کلیک کنید تا توضیحات فایل برای شما نمایش داده شود.

* برای سهولت دانلود فایل ها توسط شما عزیزان پیشنهاد می کنیم که از نرم افزار اینترنت دانلود منیجر استفاده کنید.

5 دانلود نرم افزار اینترنت دانلود منیجر

با آرزوی خریدی مطمئن برای شما

پاورپوینت های مرتبط
ارسال نظر برای این مطلب

نام
ایمیل (منتشر نمی‌شود)
وبسایت
:) :( ;) :D ;)) :X :? :P :* =(( :O @};- :B :S
کد امنیتی
رفرش
کد امنیتی
نظر خصوصی
مشخصات شما ذخیره شود ؟ [حذف مشخصات] [شکلک ها]
تبلیغات
محل تبلیغات شما
آرشیو
آمار سایت
  • کل پاورپوینت ها: 1988
  • کل نظرات : 1