بررسی قابلیت تركیب‌پذیری عمومی و خصوصی برای صفت عملكرد در ده ایزوله خالص هموكاریون قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید

عنوان صفحه

چكیده--------------------------------------------------------------------- 1

فصل اول: مقدمه

دلایل عمده عملكرد پایین قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید در ایران ---------------------- 8

فصل دوم: بررسی منابع

تاریخچه پرورش قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید -------------------------------------- 10

آشنایی اجمالی با قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید ------------------------------------ 12

طبقه‌بندی ------------------------------------------------------------------ 12

رده بندی ------------------------------------------------------------------ 12

اندام شناسی قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید ---------------------------------------- 13

مشخصات پرگنه در كشت خالص ----------------------------------------------- 15

نامگذاری علمی قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید:-------------------------------------- 15

تقسیم بندی واحدهای سلولی میسلیوم از لحاظ تعداد و تركیب‌بندی هسته‌ای ----------- 16

‌چرخ زندگی قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید ----------------------------------------- 16

بررسی الگوهای چرخه زندگی در قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید ------------------- 19

الف ـ هموتالیسم ----------------------------------------------------- 19

ب ـ هتروتالیسم ------------------------------------------------------ 20

ژنتیك قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید --------------------------------------------- 22

روشهای بهبود نژادی در قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید:-------------------------------- 24

كشت بافت ----------------------------------------------------------------- 25

گزینش از طریق كشت تك اسپوری------------------------------------ 26

تهیه نقش اسپور ------------------------------------------------------------- 26

الف ـ كشت و گزینش تك اسپوری --------------------------------------- 26

ب ـ كشت و گزینش چند اسپوری --------------------------------------- 27

اختلاط ساده---------------------------------------------------------------- 28

تلاقی هدفمند هموكاریون‌ها---------------------------------------------------- 28

بدست آوردن هموكاریون و تایید آنها----------------------------------- 29

1ـ روش سنتی تأیید هموكاریون‌ها--------------------------------------- 29

2ـ تهیه و تایید هموكاریونهای والدی به روش تهیه پروتوپلاست ---------------- 30

3ـ تایید هموكاریونها با استفاده از نشانگر RFLP------------------------------ 30

4ـ تایید هموكاریون‌ها با استفاده از نشانگر RAPD --------------------------- 31

انجام تلاقی بین هموكاریونها و تایید هیبریدها: ---------------------------- 32

الف ـ استفاده از نشانگرهای غذایی برای تایید هیبریدها:---------------------- 33

ب ـ استفاده از آیزوزایم‌ها برای تایید هیبریدها: ----------------------------- 34

ج ـ استفاده از نشانگرهای مقاومت برای تأیید هیبرید‌ها----------------------- 34

اصلاح برخی صفات با استفاده از روش تلاقی هیبریدها: ----------------------------- 34

د ـ استفاده از نشانگرهای مورفولوژیكی برای تایید هیبریدها: ------------------ 35

مراحل انجام آزمون اصلاحی از طریق دورگ‌گیری هدفمند: --------------------- 35

1ـ كشت اسپور------------------------------------------------------- 35

2ـ جداسازی تك اسپورها ---------------------------------------------- 36

3ـ تهیه اسپاون ------------------------------------------------------ 36

آزمون میوه‌دهی ------------------------------------------------ 36

الف ـ تهیه بستر كشت: ------------------------------------------------ 36

ب ـ مراحل پرورش و میوه‌دهی: ----------------------------------------- 37

تولید پریموردیا در سطح محیط كشت: ------------------------------------------- 38

تولید اجسام میوه دهی در اسپاون----------------------------------------------- 38

‌ج ـ تولید اندام باردهی در كمپوست-------------------------------------- 39

مهندسی ژنتیك------------------------------------------------ 39

1ـ انتقال ژن --------------------------------------------------------- 39

2ـ اختلاط پروتوپلاستها------------------------------------------------ 40

فصل سوم: مواد و روشها

تهیه نژادها ----------------------------------------------------------------- 42

روش تهیه محیط كشت غذایی PDA--------------------------------------------- 42

روش كشت هموكاریون‌ها ----------------------------------------------------- 43

روش تلاقی هموكاریون‌ها------------------------------------------------------ 44

نمونه‌گیری از منطقه تلاقی ---------------------------------------------------- 45

تهیه اسپاون مادری از هیبریدها------------------------------------------------- 45

تلقیح دانه‌های گندم با كشت هیبرید--------------------------------------------- 46

تهیه بستر كشت (كمپوست)---------------------------------------- 47

الف ـ پاستوریزاسیون و آمونیاك‌زدایی ------------------------------------- 49

ب ـ مایه‌زنی كمپوست ------------------------------------------------- 49

ج ـ خاك‌دهی بستر كشت---------------------------------------------- 49

هوادهی و افت سریع دما------------------------------------------------------- 50

محاسبه قابلیت تركیب‌پذیری عمومی و خصوصی ----------------------------------- 53

محاسبه واریانس تركیب‌ پذیریی عمومی و خصوصی--------------------------------- 53

محاسبه واریانس  افزایشی و غالبیت---------------------------------------------- 53

فصل چهارم نتایج و بحث

نتایج بررسی سرعت رشد (قطر پرگنه هموكاریون‌ها)-------------------------------- 55

تیپ رشدی پرگنه هموكاریون -------------------------------------------------- 55

نتایج سرعت رشد در هتروكاریو‌ن‌ها --------------------------------------------- 59

نتایج مشاهده‌ای تهیه اسپاون -------------------------------------------------- 60

نتایج مشاهدای آزمون میوه‌دهی ------------------------------------------------ 60

جدول تجزیه واریانس برای صفت عملكرد در دورگ‌ها ------------------------------- 61

جدول قابلیت تركیب‌پذیری عمومی در هموكاریون‌ها -------------------------------- 64

جدول قابلیت تركیب‌پذیری خصوصی دورگ‌ها ------------------------------------- 64

جدول مقادیر اجزاء ژنتیكی ---------------------------------------------------- 66

ضریب همبستگی ------------------------------------------------------------ 66

پیشنهادات ----------------------------------------------------------------- 67

منابع ---------------------------------------------------------------------- 69

پیوست--------------------------------------------------------------------- 75

چكیده انگلیسی ------------------------------------------------------------- 78

امروزه تأمین غذا و بویژه پروتئین در كشورهای در حال توسعه به یكی از مسائل بنیادی تبدیل شده است. پروتئین مورد نیاز انسان از دو منبع اساسی شامل منابع حیوانی و دیگری منابع گیاهی قابل تأمین است. پروتئین گیاهی شامل حبوبات، غلات و میوه‌جات و سبزیجات است و پروتئین حیوانی عمدتاً شامل گوشت دامها، طیور، آبزیان و فراورده‌های لبنی و دامی می‌باشد. در ایران، كمبود میزان بارش سالیانه، تخریب اراضی كشاورزی، جنگلها و مراتع، آلودگی بیش از حد منابع آبی، عدم استفاده صحیح و اصولی از نهاده‌های زراعی و مهمتر از همه سوء مدیریت، باعث مشكلات زیادی در تأمین پروتئین شده است. هم اكنون كشور ما بیش از 65 میلیون جمعیت دارد و پیش‌بینی می‌شود تا سال 1400 هجری شمسی این رقم به80 میلیون نفر برسد. با افزایش روزافزون جمعیت و تغییر الگوی مصرف مقدار غذای سرانه و مصرف كل غذا افزایش خواهد یافت. با توجه به مشكلات فوق، در آینده یكی از بحرانی‌ترین مسائل كشور ما، مسئله تأمین پروتئین خواهد بود. در این میان تولید و پرورش قارچ خوراكی از چند نظر حائز اهمیت است، كه عبارتند از:

1ـ تأثیر اندك شرایط محیطی و آب و هوایی بر پرورش قارچ خوراكی:

قارچ خوراكی در بیشتر مناطق آب و هوایی كشور بدون تجهیزات و امكانات ویژه قابل پرورش است. زیرا تولید و پرورش آن در مكان‌های كنترل شده و سربسته صورت می‌گیرد. همچنین پرورش قارچ از لحاظ صرفه‌جویی در استفاده از زمین، قابل توجه می‌باشد.

2ـ صرفه اقتصادی:

برای تولید و پرورش قارچ خوراكی از بقایای گیاهی محصولات كشاورزی از قبیل كاه و كلش و سایر مواد زاید گیاهی استفاده می‌شود و نیز كمپوست مصرف شده در پرورش قارچ، می‌تواند به عنوان كود آلی مرغوب در باغها و مراتع مورد استفاده قرار گیرد. از سوی دیگر تهیة منابع پروتئینی دیگر، در مقایسه با قارچ، هزینه بشتری دارد.

3ـ ارزش غذایی:

قارچ خوراكی با میزان پروتئین 30ـ25 درصدی هم‌ردیف حبوبات و بالاتر از سبزیجات و میوه‌ها قرار دارد. همچنین هضم 80ـ70 درصدی پروتئین قارچ حائز اهمیت است و میزان كربوهیدرات‌ها و كلسترول در آن پایین است. به دلیلی پایین بودن كالری در قارچ یك رژیم غذایی مناسب برای لاغری است. قارچ‌های خوراكی دارای تركیبات ضدسرطان نیز می‌باشند. با مصرف قارچ‌های خوراكی می‌توان ویتامین‌های C,E,K,D,A و گروه (B6, B2, B1) B و املاح معدنی مانند پتاسیم، كلسیم، فسفر و مقادیری آهن مورد نیاز بدن را تأمین كرد. برخی از اسیدهای آمینه در قارچ‌ خوراكی شامل لیزین، تریپتوفان، تریپسین و اسید فولیك می‌باشد (محمدی گل تپه، 1379).

همچنین مقایسه برخی از اسیدآمینه‌های موجود در قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید با تخم‌مرغ، كه یك منبع غذایی غنی از پروتئین می‌باشد، در جدول 2 آمده است (چنگ و مایلز، 1989)[1].

جدول 1ـ ارزش غذایی قارچ خوراكی تازه به شرح جدول زیر می‌باشد (غلامعلی پیوست، 1375).

جدول 2ـ مقایسه برخی از اسیدهای آمینه موجود در قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید با تخم‌مرغ:  (در 100 گرم پروتئین)

4ـ اشتغال‌زایی:

چنانچه در زمینه ترویج، توسعه و حمایت از پرورش قارچ خوراكی در مناطق مختلف كشور بخصوص روستاها فعالیت شود، می‌توان علاوه بر تأمین مواد غذایی گام مؤثری در جهت ایجاد اشتغال جنبی مناسب و افزایش درآمد كشاورزان برداشت.

در بین قارچهای خوراكی، قارچ تكمه‌ای سفید رایج‌ترین قارچی است كه در سراسر جهان كشت می‌شود. پرورش قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید در اواسط قرن هفدهم میلادی در فرانسه شروع شده و از دهة 1960 تولید آن به صورت صنعت بزرگی، درآمده است. در مجموع به طور متوسط قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید 38 درصد كل تولید قارچ خوراكی در دنیا را، به خود اختصاص داده است 
(دفتر امور  گل و گیاهان زینتی و قارچ‌های خوراكی وزارت جهاد كشاورزی، 1382).

علیرغم اهمیت اقتصادی و تجاری قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید، برنامه اصلاحی برای بهبود عملكرد آن، با مشكلاتی همراه است. یكی از مهم‌ترین مشكلات، به چرخه نامعمول زندگی این قارچ برمی‌گردد كه غالباً بجای تشكیل بازیدیوسپورهای تك هسته‌‌ای،  بازیدیوسپورهایی حاوی دو هسته هاپلوئید متفاوت و سازگار از نظر جنسی، تولید می‌كند (استوپ و مایبروك، 1999)[2]. مشكل دیگر، عدم وجود اختلافات مورفولوژیكی قابل مشاهده، بین میسلیوم‌های با منشأ تك اسپوری و چند اسپوری می‌باشد (كریگان، 1992)[3].  همچنین از نظر تندش اسپور، كه به عنوان اولین گام در یك برنامه اصلاحی است، بسیار ضعیف و ناهماهنگ است (چنگ و مایلز، 1989)[4]. از دهة 1970 میلادی، الگوی جنسی و چرخه كامل زندگی این قارچ به دقت مورد مطالعه قرار گرفته است. متوسط سرانه مصرف قارچ خوراكی در دنیا، در حدود 5/2 كیلوگرم است در حالی كه این میزان در ایران، تنها 160 گرم است و متوسط سرانه مصرف قارچ خوراكی در ایالات متحد امریكا حدود یك كیلوگرم می‌باشد. میزان تولید سالیانه قارچ خوراكی تكمه‌ای سفید در آلمان، در سال 1959، حدود 5100 تن و در سال 1965، حدود 9000 تن و در سال 1967، به مرز 15000 تن رسید در سال 1969 ارزش نقدی تولید جهانی این قارچ از مرز یك میلیارد مارك گذشته بود (غلامعلی پیوست، 1375).

انجام تلاقی بین هموكاریونها و تأیید هیبریدها:

طبق گزارش كسل و همكاران در سال 1988 می‌توان دو نژاد مختلف هموكاریون را به فاصله 2ـ1 سانتیمتر از هم در یك ظرف پتری حاوی محیط كشت غذایی تازه قرار داد. ظرف پتری به مدت دو تا چهار هفته در درجه حرارت  درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود. در این مدت میسلیوم‌های هموكاریون به طرف یكدیگر رشد می‌كنند. سپس از منطقه تلاقی دو هیف، ریز نمونه‌هایی برداشت می‌شود و به محیط كشت تازه، منتقل می‌شود. مورفولوژی پرگنه‌های بدست آمده از ناحیه تلاقی و پرگنه والدین هموكاریون مقایسه می‌شود (كسل و همكاران، 1988).[1] طبق گزارش مهتا و همكاران در 1994 موقعی كه تلاقی انجام می‌شود، یكی از نشانه‌های انجام هیبرید این است كه دورگ‌ها، تولید میسلیوم‌های رشته‌ای و ضخیم می‌‌كنند. در اینجا فرض شده است كه هر كدام از والدین هموكاریون به تنهایی تولید اندام باردهی نمی‌كنند و در صورت تلاقی موفقیت‌آمیز، دو رگ به دست آمده می‌تواند در آزمون میوه‌دهی تولید اندام باردهی كند (مهتا و همكاران، 1994).[2]

طبق گزارشات كسل و همكاران در سال 1988 از 16 تلاقی موفقیت‌آمیز با روش RFLP كه قابل شناسایی بودند سایر تلاقی‌ها كه با شكست روبرو شدند، الگوی باندی یكی از والدین را نشان می‌دادند. همچنین طبق آزمایشی كه توسط خوش و همكاران در سال 1992 صورت گرفت، هیبریدی حاصل از تلاقی دو هموكاریون  مورد سنجش قرار گرفت. نتایج تك اسپور هیبرید حاصله هنگامی كه تولید اندام باردهی كرد، مورد ارزیابی RAPD قرار گرفت. نتایج تك اسپور جدا شده در محیط كشت‌، تندش كرده‌ و رشد آنها از حالت خیلی سریع تا خیلی كند درجه‌بندی شد. سپس از تك‌اسپور‌های جدا شده، استخراج DNA شد و برای واكنشهای RAPD مورد استفاده قرار گرفت. براساس ژنوتیپ‌های دوهموكاریون والدی، مشخص شد كه سیزده مكان ژنی هتروآللیك، در هیبرید وجود دارد.

در این آزمایش، پنج تك اسپور رشد كند داشتند كه به احتمال قوی باریدیوسپورهایی با یك هسته هاپلوئیدی یا بازیدیوسپورهایی با دو هستة خواهری داشته‌اند. اسپورهایی كه تمام باندها را نشان دادند، به احتمال قوی، هتروكاریونهایی با دو هسته غیرخواهری می‌باشند.  كالو‌و ـ بادو نیز  در سال 2000 از نشانگر‌ RAPD جهت تأیید‌ تشكیل هترو‌كاریون‌، بین جدایه‌های تك‌اسپور استفاده نمود. وی مشاهده كرد كه DNA هترو‌كاریونی، دارای باند‌های مشترك هر دو همو‌كاریون بوده ونیز دارای باند‌های اختصاصی همو‌كاریون ویژه هستند و یا اینكه فاقد باند‌های رایج در هر دو همو‌كاریون می‌باشند. بنابراین برخی فرآورده‌های RAPD موجود در اجزاء همو‌كاریونی، در طی تشكیل هترو‌كاریون از دست رفته‌اند و فقدان باند‌ها نشان‌دهندة تشكیل هترو‌كاریون است
(كالوو ـ بادو و همكاران، 2000).[3]

الف‌ـ استفاده از نشانگرهای غذایی برای تأیید هیبریدها:

نشانگرهای غذایی براساس نیازمندیهای رشدی، نظیر اسیدهای آمینه ویژه، ویتامین‌ها و غیره تعیین می‌شوند. یك هیبرید می‌تواند از دو نژادی كه هر كدام نیازمندی رشدی متفاوتی دارند، تشكیل شود (مهتا و همكاران 1994). [4] آنچنان كه در هیبرید حاصله هر كدام از نژادها، نیاز نژاد دیگر را برطرف می‌كند. البته نشانگرهای غذایی به آسانی در دسترس نیستند و به علاوه ممكن است حتی در صورت موجود بودن، به دلیل اثر پوشانندگی سلولهای میسلیومی چندهسته‌ای، قابل تشخیص نباشند بنابراین، برای اهداف ویژه، امكان به دست آوردن نشانگرهای غذایی مطلوب، برای هر نژاد وجود ندارد.

ب‌ـ استفاده از آیزوزایم‌ها برای تأیید هیبریدها:

آیزوزایمها فرمول‌های مولكولی چندگانه یك آنزیم هستند و توسط ژنهای جداگانه، كنترل می‌شوند، آیزوزایمها در ژل الكتروفورز تولید باندهایی می‌كنند كه براساس الگوهای باندی گروههای مختلف آنزیم‌ها برای یك نژاد ویژه، مشخص می‌شوند. از این روش در آمریكا برای تأیید هیبریدها، استفاده زیادی شده است. در آزمایش رویز و همكاران در 1983 میلادی تنها درصد كمی از نمونه‌ها (كمتر از 5درصد) در چندین مكان ژنی، هموزایگوس بودند كه نشان می‌داد، آنها هموكاریون هستند (رویز و همكاران، 1983).[5]

[1] - Castle et al., 1988

[2] - Mehta et al., 1994

[3] - Calvo – Bado et al., 2000

[4] - Mehta et al., 1994

[5] - Royes et al., 1983